Descrição
A cromatografia líquida de alta performance – CLAE (High Performance Liquid Chromatography-HPLC), marca Shimadzu, modelo LC-20 AD com injetor manual e detector UV-Vis com possibilidade de leitura em dois comprimentos de onda distintos. Possui coluna C-18 (250 mm x 4.6 mm x 5 μm), bomba quaternária de alta pressão, sistema de mistura para até quatro solventes (gradiente). O software para aquisição dos dados é o LabSolutions.
Técnica
A técnica consiste na separação analítica que identifica e quantifica componentes de uma amostra em solução, por meio do bombeamento da fase móvel pressurizada contendo a amostra que passa através da coluna. Cada componente da amostra interage de forma diferenciada com as partículas de sílica modificada da coluna (fase estacionária), com diferentes velocidades o qual produz a separação de cada um deles à medida que percorrem a coluna, como é ilustrado na figura 1. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma. A técnica possibilita a realização de ensaios com resultados de alta confiabilidade.
Figura 1: Separação cromatográfica entre os analitos, evidenciando que o as moléculas representadas esquematicamente em azul possuem maior interação com a coluna, em relação às moléculas representadas em vermelho.
FONTE: Coutrim, (2020).
Aplicação
Curva de calibração, validação de metodologia analítica, cinética química, separação analítica, quantificação de analitos, controle de qualidade, determinação de formulações, estudo de estabilidade e degradação.
Observações
Purgar o sistema antes de usar, não deixar entrar bolhas de ar no sistema. Sempre verificar o valor da pressão para não deixar ultrapassar o limite da coluna cromatográfica. Antes de cada análise deixar a coluna estabilizar com a fase móvel até que os sinais de pressão e absorção no ultravioleta/visível estejam estáveis. O Solvente para fase móvel grau HPLC ou PA filtrado em membrana 0,22 μm. Caso seja utilizada uma fase móvel tamponada deve-se sempre passar água antes e após a finalização dos experimentos para evitar o acúmulo de sais no sistema cromatográfico. O pH da amostra e fase móvel devem estar entre 2 e 8.
Fotos
Figura 2:Equipamento HPLC marca Shimadzu, modelo LC-20 AD com injetor manual e detector UV-Vis.
FONTE: BIOPOL, (2020).
Figura 3: Curva de calibração obtida pela técnica HPLC.
FONTE: BIOPOL, (2020).
Figura 4: Separação cromatografia de diferentes analítos.
FONTE: BIOPOL, (2020).
Autores
- Maria Jackeline R. dos Santos
- Romelly Rojas.
Revisado e modificado por: Rilton Alves de Freitas
Termo de responsabilidade para o uso dos equipamentos do laboratório
Referências
Coutrim, M. Princípios de cromatografia. disponível em http://professor.ufop.br/sites/default/files/mcoutrim/files/qui346_cromatografia_a_gas_10a_a_12a_aula_2016-1.pdf acesso em ago. 2020
Zoloco, G. J. Princípios e aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Conselho Regional de Química IV Região (SP). 2012