Descrição
A Cromatografia por exclusão de tamanho, em inglês Size Exclusion Chromatography, equipamento Viscotek com sistema múltiplo de detecção, injetor manual, detectores UV-Vis (VE3210), índice de refração (VE3580) e espalhamento de luz (270 dual detector) de baixo ângulo 7° (LALLS) e ângulo reto 90° (RALLS). Pré-coluna Shodex OH-pack SB-G. Opera com coluna Shodex OH-pack SB-806M HQ, com limite de detecção de 2×107 g\(\cdot\)mol-1 e dimensão 8 mm x 300 mm. O software utilizado para a análise e aquisição dos dados é o OmniSec 4.7 (Viscotek).
Técnica
A cromatografia por exclusão de tamanho é uma técnica analítica que separa dispersões de macromoléculas por tamanho com base em sua eluição de colunas preenchidas com um gel poroso, em que as partículas maiores são menos acessíveis aos poros do gel e eluem primeiro, enquanto que as partículas menores, permeia o interior e o exterior dos poros dos géis, aumentando o tempo de eluição. Após a eluição da amostra as frações de diferentes tamanhos são analisadas por o espalhamento de luz laser em múltiplos ângulos (MALLS) e o índice de refração, detector de concentração. A partir desta informação, calcula-se a massa molar dos componentes na mistura.
Figura 1: Princípio de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC)
FONTE: Pasch et al., (1999).
As partículas ou polímeros maiores que o tamanho dos poros, não podem entrar nos poros, e eles são eluídos no volume intersticial (\(V_i\)). Nenhuma fração pode sair da coluna antes que \(Vi\) , este vai indicar o limite de exclusão da coluna e o volume morte. Moléculas pequenas, que têm acesso a todo o volume de poro \(V_p\), aparecerão em um volume de eluição igual à soma do volume intersticial \(V_i\) e do volume do poro (\(V_p\)), ou seja, o volume total da coluna (\(V_t\)). As moléculas de tamanho entre esses extremos têm acesso apenas a uma parte do volume do poro; portanto, eles serão eluídos em um volume de eluição \(V_e\), que é dado pela equação abaixo.
\[V_e = V_i + K_{sec} \ V_p\]
Onde \(K_{sec}\) é a constante de equilíbrio de uma amostra com tamanho de cromatografia de exclusão \(0 < K_{sec} < 1\).
Aplicação
A técnica de SEC, acoplada aos multidetectores é usado para caracterizar polímeros naturais e sintéticos, biopolímeros, proteínas ou nanopartículas, conseguindo a separação e quantificação de misturas entre eles, e permitindo a determinação da massa molar, viscosidade intrínseca, conformação molecular, agregação, ramificações ou linearidade dos polímeros.
Observações
Antes de realizar o experimento deve-se manter o equipamento na fase móvel escolhida por 12 h. São utilizadas fases móveis aquosas no equipamento, assim apenas polímeros hidrossolúveis podem ser analisados. Os detectores de viscosidade devem ser purgados apenas com água contendo azida e os detectores de índice de refração e espalhamento de luz com a fase móvel; preparar a solução de amostra com a mesma da fase móvel em uso no sistema cromatográfico e as amostras devem ser filtradas em membrana de éster de celulose de pelo menos 0,45 μm.
Fotos
Figura 2: Detector UV-Vis Viscotek VE 3210.
FONTE: BIOPOL, (2020).
Figura 3: Detector de espalhamento de luz Viscotek 270 dual detector.
FONTE: BIOPOL, (2020).
Detector de espalhamento de luz Viscotek 270 dual detector
Autores
- Bernardo Mauad Régnier
- Romelly Rojas
Revisado e modificado por: Rilton Alves de Freitas
Termo de responsabilidade para o uso dos equipamentos do laboratório
Referências
Rübsam, H., Krottenthaler, M., Gastl, M. and Becker, T. (2012), An overview of separation methods in starch analysis: The importance of size exclusion chromatography and field flow fractionation. Starch, 64, 683-695, 2012.
Pasch et al., HPLC of Polymers © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1999.
Introduction to Size Exclusion Chromatography, disponivel em <https://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/introduction-size-exclusion-chromatography?ID=MWHAXJKG4>, acesso em setembro de 2020.
Principles of gel filtration chromatography/ size exclusion chromatography, disponivel em <https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ>, acesso em setembro de 2020.